RNA İnterferans Teknolojisinin Büyük Beyaz Lahana Kelebeği, Pieris brassicae’nın Biyolojik Mücadelesinde Kullanılabilirliğinin Araştırılması

Abstract

Proje Özeti RNA interferans (dsRNA), uygun çift zincirli RNA’nın hücreye girdiği zaman, endojenik komplementer mRNA dizisinin parçalanmasına yol açan, transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizmasıdır. dsRNA yaklaşımı son yıllarda tarım ve orman ürünlerine zarar vererek ekonomik kayba sebep olan böcek popülasyonlarının kontrolünde kullanılmaktadır. Kimyasal pestisitlerin kullanımının azaltılmasına karşı iyi bir potansiyele sahip olduğu bilinen bu teknoloji özellikle gen susturulmasına karşı direnç geliştirme riskinin orta düzeyde olması, hedef olmayan türleri etkilemeden büyük bir doğrulukla ilgili mRNA’yı hedefleyebilmesi, geniş ekim alanlarına püskürtülebilir formlarda formüle edilebilmesi, böylece böcekleri seçici olarak hedefleyebilmesi ve hem emici-sokucu hem de çiğneyici böcekler için etkili olması gibi pek çok avantaja sahiptir. Pieris brassicae (büyük lahana kelebeği), Lepidoptera takımında bulunan kozmopolit bir tarım zararlısıdır. Ergin bireyler yumurtalarını paket halinde lahana yapraklarının üzerine bırakmaktadır. Kısa bir süre sonra yumurtadan çıkan larvalar, lahana yapraklarının sadece kalın ana damarları kalana kadar tüm bitkiyi tüketmektedir. Larvalar, beslenmeye devam etmek için yeni bitkilere geçmekte ve hızlı bir şekilde çok geniş bir alana yayılmaktadır. Zararlının mücadelesinde kullanılan kimyasal ilaçlar, hedef olmayan organizmalara da zarar vermektedir. Lahana yaprağı üzerinde kalıntı bırakan kimyasal ilaçlar hem insanların sağlığını tehdit etmekte hem de ürünlerin ihracatında sorun yaşanmasına neden olmaktadır. Ayrıca, larvaların zaman içinde kimyasal ilaçlara karşı direnç geliştirmesi, uygulanan kimyasal ilaç miktarının artmasına böylece doğa ve insan sağlığı üzerinde de daha ciddi boyutta zararlar oluşmasına neden olacaktır. Bu durum hem ülkemizde hem de dünyada büyük lahana kelebeğine karşı çevre dostu alternatif kontrol sistemlerinin geliştirilmesine olan ihtiyacı artırmıştır. Önerilen projede önemli bir tarım zararlısı grubu olan P. brassicae larvalarının mücadelesi için dsRNA teknolojisi ile hedef böcekte hayati bir gen olan kitinaz-3 (chit-3) geni susturarak bu böceğe özgü konak spesifik bir mücadele yöntemi geliştirilmesi araştırılacaktır. Önemli bir biyolojik polimer olan kitin böcekler dahil olmak üzere tüm eklembacaklılarda bulunmaktadır. Kitin polimeri ve bu polimerin senteziyle ilgili olan enzimler bitki ve insanlarda bulunmamaktadır. Bu nedenle dsRNA ile chit-3 geninin susturulması insan ve bitkiler üzerine olumsuz etki bırakmayacak çevre dostu bir yöntemdir. Bu çalışmada, P. brassicae larvalarından chit-3 geni çoğaltılacak ve ardından dsRNA sentez vektörüne (L4440) klonlanacaktır. dsRNA sentezi E. coli DE3 suşunda gerçekleştirilecektir. Daha sonra, dsRNA ifade edilen bakteri besin ile birlikte P. brassicae larvalarına verilecektir. dsRNA’ın böcekler üzerine etkisi biyotest denemelerinde incelenecektir. Ayrıca moleküler düzeyde hedef genin ifade seviyesi qRT-PCR ile analiz edilecekitr. Böylece P. brassicae larvalarının zirai mücadelesinde RNAi yaklaşımı kullanılması dünyada ilk defa bu çalışma ile gerçekleştirilecektir. Proje, ülkemiz 2023 hedefleri ve ulusal biyoteknoloji Araştırma-Geliştirme ve Yenilik Stratejisi kapsamında kurgulanan ve genç bilim insanı yetiştirme potansiyeline sahip bir proje olmakla önemli yaygın etki oluşturma potansiyelindedir.

RNA interference (dsRNA) is a post-transcriptional gene silencing mechanism that leads to degradation of the endogenous complementary mRNA sequence when the appropriate double-stranded RNA enters the cell. The dsRNA approach has been used in recent years to control insect populations that cause economic losses by damaging agricultural and forest products. This technology, which is known to have good potential against reducing the use of chemical pesticides, has a moderate risk of developing resistance to gene silencing, can target the relevant mRNA with great accuracy without affecting non-target species, can be formulated in forms that can be sprayed on large cultivation areas, thus selectively targeting insects. It has many advantages, such as being effective against both sucking-stinging and chewing insects. Pieris brassicae (large cabbage butterfly) is a cosmopolitan agricultural pest in the order Lepidoptera. Adult individuals lay their eggs in packs on cabbage leaves. The larvae hatch after a short time and consume the entire plant until only the thick main veins of the cabbage leaves remain. The larvae move to new plants to continue feeding and quickly spread over a wide area. Chemical pesticides used to control pests also harm non-target organisms. Chemical pesticides that leave residues on cabbage leaves both threaten people's health and cause problems in the export of products. In addition, the larvae's development of resistance to chemical pesticides over time will result in an increase in the amount of chemical pesticides applied, thus causing more serious damage to nature and human health. This situation has increased the need for the development of environmentally friendly alternative control systems against the large cabbage butterfly both in our country and in the world. In the proposed project, will be investigated to develop a host-specific control method for this insect by silencing the chitinase-3 (chit-3) gene, a vital gene in the target insect, with dsRNA technology for the control of P. brassicae larvae, an important agricultural pest group. Chitin, an important biological polymer, is found in all arthropods, including insects. Chitin polymer and the enzymes involved in the synthesis of this polymer are not found in plants or humans. Therefore, silencing the chit-3 gene with dsRNA is an environmentally friendly method that will not have any negative effects on humans and plants. In this study, the chit-3 gene will be amplified from P. brassicae larvae and then cloned into the dsRNA synthesis vector (L4440). dsRNA synthesis will be carried out in the E. coli DE3 strain. Then, the dsRNA- expressed bacteria will be administered to P. brassicae larvae along with the food. The effect of dsRNA on insects will be examined in biotest trials. Additionally, the expression level of the target gene at the molecular level will be analyzed by qRT-PCR. Thus, this study will be the first in the world to use the RNAi approach in the agricultural control of P. brassicae larvae. The project has the potential to create a significant widespread impact as it is a project designed within the scope of our country's 2023 targets and the national biotechnology Research-Development and Innovation Strategy and has the potential to train young scientists.