İnsan Beta-Defensin-2 (HBD-2) Proteinin Pichia Pastoris’te Rekombinant Üretimi ve İnsan ACE-2 Reseptör Proteini ile in vitro Etkileşimlerinin İncelenmesi

Abstract

Antimicrobial peptides or proteins (AMPs) are small, cationic and amphipathic polypeptide sequences that are effective against bacteria, fungi and viruses. These molecules are biologically active molecules produced by organisms as an important component of the innate immune response against pathogens. The antiviral activity of AMPs has been demonstrated against enveloped RNA and DNA viruses, with the exception of some non-enveloped viruses. With the spread of the Covid-19 pandemic around the world, in addition to vaccine studies, the determination of drug candidate molecules to be used in treatment has been a subject that has been started to be studied rapidly. In this context, AMPs have important therapeutic properties. In this study, it was aimed to investigate the recombinant production of human β defensin-2 (hBD-2) protein and the interactions of human angiotensin converting enzyme-2 (ACE-2). First of all, hBD-2 protein was produced in Pichia pastoris (Komagataella phaffii) by means of the vector system using recombinant DNA technology, and its activity was demonstrated by various antimicrobial tests. Its production has been proven by SDS-PAGE and western blotting techniques. Then, the bindings showed between hBD-2 and ACE-2 proteins by in silico analyzes ve in vitro binding test (Pull Down Assay) was conducted with SDS-PAGE. Our results suggest that by binding of ACE-2 and hBD-2 in vitro, the innate immune system is important and affects the course of the disease. As a result, we suggest that the recombinantly produced hBD-2 protein may be protective against SARS-CoV-2 and be used as an adjunct in treatment. However, current findings need to be supported by cell culture studies, toxicity and in vivo experiments.

Antimikrobiyal peptitler veya proteinler (AMP) bakterilere, funguslara ve virüslere karşı etkili olan küçük, katyonik ve amfipatik polipeptit dizileridir. Bu moleküller patojenlere karşı doğuştan gelen bağışıklık cevabının önemli bir bileşeni olarak organizmalar tarafından üretilen biyolojik aktif moleküllerdir. AMP'lerin antiviral aktivitesi, bazı zarfsız virüsler dışında, zarflı RNA ve DNA virüslerine karşı gösterilmiştir. Covid-19 pandemisinin dünya genelinde yayılması ile birlikte aşı çalışmalarına ek olarak tedavide kullanılacak ilaç adayı moleküllerin belirlenmesi de hızla çalışılmaya başlanılan bir konu olmuştur. AMP molekülleri bu bağlamda önemli terapötik özellikler taşımaktadır. Bu çalışmada, antimikrobiyal proteinlerden insan β defensin-2 (hBD-2) proteininin rekombinant üretimi ve insan anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 (ACE-2)’nin in vitro koşullar altında etkileşimlerinin incelenmesi amaçlanmıştır. İlk olarak hBD-2 proteinin Pichia pastoris (Komagataella phaffii) mayasında rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak hazırladığımız vektör sistemi sayesinde üretimi gerçekleştirilmiş, aktivitesi çeşitli antimikrobiyal testlerle gösterilmiştir. SDS-PAGE ve western blotlama teknikleri ile üretimi kanıtlanmıştır. Ardından, in siliko analizlerle hBD-2 ve ACE-2 proteinleri arasında gösterdiğimiz bağlanmalar in vitro bağlanma testi (Pull Down Assay) ile ortaya koyulmuş ve SDS-PAGE tekniği ile gösterilmiştir. Sonuçlarımız, ACE-2 ve hBD-2’nin in vitro koşullarda bağlanmasıyla, doğal bağışıklık sisteminin önemli olduğunu ve hastalığın seyrini etkilediğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, rekombinant olarak üretilen hBD-2 proteinin SARS-CoV-2’ye karşı koruyucu olabileceği ve tedavide yardımcı olarak kullanılabileceğini önermekteyiz. Ancak mevcut bulguların, ileri hücre kültürü, toksisite ve in vivo deneylerle desteklenmesi gerekmektedir.