Pieris brassicae’den izole edilen Serratia ficaria bakterisine ait kitinaz proteinlerinin moleküler karakterizasyonu ve virulans etkisinin belirlenmesi

Abstract

Brassicae (Lahanagiller) familyasında bulunan sebzeler, sağlık ve besin değeri açısından oldukça önemlidir. Özellikle bu familyadan olan lahananın Dünya tarım arazilerinde yetiştiriciliği sıklıkla yapılmaktadır. Birçok zararlı ve hastalık etmeni ise ürünlerin kalite ve ürün veriminde düşüşe neden olmaktadır. Lahana yetiştiriciliğine olumsuz etki eden biyotik etmenlerin başında ‘pest’ olarak adlandırılan zararlı böcekler gelmektedir. Bu familyanın en önemli zararlıları Lepidoptera takımında yer almaktadır. Büyük lahana kelebeği, Pieris brassicae en önemli lahana zararlılarındandır. Larva döneminde bitkinin yapraklarını yemesi nedeniyle bitkiye büyük hasar vermektedir. Büyük lahana kelebeği, bitkinin yapraklarını neredeyse tamamen tükettikten sonra beslenmeye devam etmek için tarım alanındaki diğer bitkilere geçerek hızlı bir şekilde çok geniş bir alana yayılmaktadır. Bunun sonucunda lahana türlerinin üretiminde büyük miktarda yıllık ürün kayıpları oluşmaktadır. Tarım zararlılarını kontrol etmek için kimyasal ürünlere alternatif olarak kullanılan çevre dostu entomopatojenik mikroorganizmalara olan talep gün geçtikçe artmaktadır. Kimyasal ilaçların, zamanla böceklerde direnç oluşturması ve hedef organizmaya özgü olmadıkları için yararlı böceklerin ölmesine sebep olmaktadır. Ayrıca uygulama sonrasında toprakta birikerek, havaya ve suya karışarak, bitkilere ve diğer omurgalı canlılara da zarar verdiği bilinmektedir. Serratia cinsi ilk olarak 19. yüzyılın başlarında İtalya'da tanımlanmıştır. Serratia türlerinin geleneksel olarak Enterobacteriaceae'nin üyeleri olarak kabul edilen, her yerde bulunan, serbest yaşayan, hareketli Gram-negatif proteobakteriler olduğu bilinmektedir. Birçok Serratia türünün konakçısı insan olarak bilinse de bazı Serratia türleri böcekleri enfekte etmektedir. Bununla birlikte, bu türün her yerde varolabilen doğası nedeniyle çok sayıda çevresel nişte bulunduğu bildirilmiştir. S. ficaria’nın komple genom dizilemesi NCBI (National Center for Biotechnology Information) veri tabanında bulunmaktadır. Genomda böceklerin dış iskeletlerinin ve bağırsak epitel dokusunun parçalanmasına sebep olan Kitinaz A, Kitinaz B ve Kitinaz D genleri bulunmaktadır. Bu nedenle S. ficaria türü potansiyel biyoinsektisit ajanı olarak bilinmektedir.

Erzurum ilinin Pasinler ilçesindeki lahana ekili alalardan toplanan P. brassicae larvalarının laboratuvara getirildikten birkaç gün sonra toplu olarak öldükleri gözlemlenmiştir. Yapılan ön çalışma sonucunda enfeksiyon sebebi bakterinin 16S rRNA geninin yeni nesil dizilemesi sonucunda S. ficaria türü olduğu anlaşılmıştır.

Bu tez çalışmasında, yerel ve etkili S. ficaria entomopatojen izolatının kitinaz genlerinin çoğaltılması ve büyük lahana kelebeğine karşı virülans etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda ilk olarak S. ficaria kitinaz genlerinin çoğlatılması için uygun primerler dizayn edilecektir. Tüm kitinaz genleri polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile çoğaltılarak, jelden saflaştırılacaktır. Genlerin plazmite ligasyonu sağlanacak ve TA klonlaması gerçekleştirilecektir. Transformasyon sonrasında koloni seçimi yapılacaktır. Kitinaz genlerinin klonlanması için pET-3a ifade vektörü ile Gibson klonlama yöntemi kullanılacaktır. Takiben ligasyon, ifade vektörüne klonlama ve peptid sentezi gerçekleştirilecektir. Protein üretimi sonrası His-tag ekleyerek hedef peptitler saflaştırılacaktır. Tezin bir sonraki basamağında ilgili proteinler ile P. brassicae larvaları damlacık yedirme yöntemi kullanılarak enfekte edilecektir. Üretilen proteinlerin larvalar üzerindeki insektisidal etkisinin anlaşılması için ölüm oranları kaydedilecektir. Literatürde P. brassicae‘nın mücadelesi için S. ficaira’nın kullanılması ile ilgili bir çalışma yer almamaktadır. Bu tez çalışması P. brassicae ile mücadelede kullanılabilecek çevre dostu ve güvenilir bakteri kaynaklı biyopestisit üretiminde S. ficaria’dan elde edilen kitinazların kullanılması nedeniyle özgün bir çalışma olacaktır.

Vegetables in the Brassicae family are very important in terms of health and nutritional value. Especially cabbage, which is from this family, is frequently cultivated in the world's agricultural lands. Many pests and disease factors cause a decrease in the quality and yield of the products. Harmful insects called 'pest' are the leading biotic factors that negatively affect cabbage cultivation. The most important pests of this family are in the order Lepidoptera. The large cabbage butterfly, Pieris brassicae, is one of the most important cabbage pests. It causes great damage to the plant as it eats the leaves of the plant during the larval period. After consuming the leaves of the plant almost completely, the large cabbage butterfly quickly spreads over a very wide area by switching to other plants in the agricultural area to continue feeding. As a result, a large amount of annual crop losses occur in the production of cabbage species. The demand for environmentally friendly entomopathogenic microorganisms, which are used as an alternative to chemical products to control agricultural pests, is increasing day by day. Chemical pesticides create resistance in insects over time and cause beneficial insects to die because they are not specific to the target organism. It is also known that after the application, it accumulates in the soil, mixes with the air and water, and harms plants and other vertebrates.

The genus Serratia was first described in Italy in the early 19th century. Serratia spp. are known to be ubiquitous, free-living, motile Gram-negative proteobacteria traditionally considered members of the Enterobacteriaceae. Although the hosts of many Serratia species are known as humans, some Serratia species infect insects. However, this species has been reported to occupy numerous environmental niches due to its ubiquitous nature. The complete genome sequencing of S. ficaria is available in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database. The genome contains Chitinase A, Chitinase B and Chitinase D genes, which cause the destruction of the exoskeleton of insects and intestinal epithelial tissue. Therefore, S. ficaria species is known as a potential bioinsecticide agent.

It was observed that P. brassicae larvae collected from cabbage planted fields in Pasinler district of Erzurum province died en masse a few days after they were brought to the laboratory. As a result of the preliminary study, it was understood that the cause of the infection was the S. ficaria species as a result of the new generation sequencing of the 16S rRNA gene of the bacterium.

In this thesis, it was aimed to amplify the chitinase genes of the local and effective S. ficaria entomopathogen isolate and to determine the virulence effects against the large cabbage butterfly. In this context, firstly, suitable primers will be designed for amplification of S. ficaria chitinase genes. All chitinase genes will be amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method and purified from the gel. The plasmid ligation of the genes will be provided and TA cloning will be performed. Colony selection will be made after transformation. Gibson cloning method with pET-3a expression vector will be used for the cloning of chitinase genes. Subsequently, ligation, cloning into the expression vector and peptide synthesis will be performed. The target peptides will be purified by adding His-tag after protein production. In the next step of the thesis, P. brassicae larvae will be infected with the relevant proteins using the droplet feeding method. Mortality rates will be recorded to understand the insecticidal effect of the produced proteins on the larvae. There is no study in the literature on the use of S. ficaira for the control of P. brassicae. This thesis will be a unique study due to the use of chitinases obtained from S. ficaria in the production of environmentally friendly and reliable bacterial biopesticides that can be used to combat P. brassicae.