İnsan Larenks Skuamöz Hücreli Karsinomunda POFUT1 ve miR-1825'in Rollerinin Belirlenmesi

Abstract

Agresif bir malinite olan larenks skuamöz hücreli karsinomu (LSHK), dünya çapında tanısı konulan baş ve boyun skuamöz hücre karsinomlarının ikinci en yaygın görülen malin tipidir. Ülkemizde de toplam nüfus içerisinde (aynı zamanda erkeklerde) en sık görülen 8. kanser çeşidi olan LSHK’nın insidansı son 10 yıl içerisinde çok fazla değişiklik göstermeden 100.000’de 10 civarında seyretmiştir. Son on yılda LSHK’nin tanı ve tedavisinde önemli gelişmeler olmasına rağmen hala kanser nedenli ölümlerin dikkate değer sebeplerinden biridir ve ileri LSHK vakalarına karşı yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine acil bir ihtiyaç vardır. Protein O-Fukosiltransferaz 1 (POFUT1) geninin 7. ekzonunda yer alan miR-1825, insan embriyonik kök hücrelerinde ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerde reküren fonksiyon kazanımı görülen 20q11.21 kromozomal bölgesinde bulunmaktadır. 20q11.21 amplifikasyonunun insan embriyonik kök hücrelerinin, koloni oluşturma potansiyelini arttırdığını ve hücre apoptozunu azalttığı gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, 20q11.21 amplifikasyonu, insan embriyonik kök hücrelerinde kanserle ilintili çok sayıda genin zenginleşmesine neden olmuştur. Ayrıca, bu bulgulara paralel olarak çeşitli karsinomlarda mir-1825 ifadesinin önemli ölçüde arttığı rapor edilmiş, miR-1825’in içerisinde yerleşik olduğu POFUT1 geninin ise hepatoselüler karsinom, gastrik kanser, beyin kanseri, kolorektal kanser ve oral skuamöz hücre karsinomu gibi birçok kanser türünde artan ifadeye sahip olduğu gösterilmiştir. The Cancer Genome Atlas (TCGA) veritabanında mevcut bulunan 522 adet baş ve boyun kanseri örneği ile 44 adet normal baş ve boyun doku örneğine ait gen ifade verilerini kullanarak yapmış olduğumuz biyoinformatik analiz ise POFUT1 ifadesinin tümör örneklerinde normal doku örneklerine göre anlamlı bir şekilde artış gösterdiğini ortaya koymuştur. Bunlara ek olarak, son dönemde CD133+ ve CD133- LSHK örneklerinin mikroRNA profilini karşılaştırdığımız çalışmamız ise, miR-1825’in CD133+ larenks kanseri kök hücrelerinde önemli ölçüde artan ifadeye sahip olduğunu göstermiştir. Bu bulgular dikkate alındığında aynı lokustan ifade olunan POFUT1 ve miR-1825’in artmış ifadelerinin kanser oluşumu ve gelişimi ile ilgili önemli roller üstlendiği hipotezi ileri sürülebilir. Ne var ki bu genlerin LSHK oluşumu esnasındaki etki mekanizmaları ile larenks kanser kök hücre özelliklerine katkısı ileri fonksiyonel çalışmalarla henüz araştırılmamıştır. Bu çalışma kapsamında öncelikli olarak Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Kulak-Burun Boğaz Anabilim Dalı’ndan alınacak, klinik ve histopatolojik olarak doğrulaması Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı’nda yapılmış 30 tümör ve bu dokulara denk gelen aynı hastalardan alınmış 30 normal larenks doku çiftinde POFUT1 ve miR-1825’in ifadelerinin değerlendirilmesi amaçlanmaktadır. Sonrasında, POFUT1 ve miR-1825’in LSHK oluşumundaki fonksiyonel etkileri, LSHK Hep-2 hücre hattının ve kontrol HuLa-PC immortalize insan larenks epitel hücrelerinin proliferasyonu, klonogenitesi, hücre göçü, invazyonu, apoptozu ve kök hücre karakteristiğini değerlendiren in vitro testlerle incelenecektir. Ayrıca, gen ifade mikroarrayleri, biyoinformatik araçlar ve lusiferaz testleri kullanılarak miR-1825’in LSHK patogenezinde rolünün daha kapsamlı anlaşılması ve miR-1825’in olası yeni hedef genlerinin tanımlanması hedeflenmektedir.

Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC), being an aggressive malignancy, is the second most commonly diagnosed malignant type of head and neck squamous cell carcinoma worldwide. The incidence of LSCC, the 8th most common cancer type, in the total population (also in males) in our country, has remained around 10 per 100,000 without significant change in the last 10 years. Although there have been significant improvements in the detection and diagnosis of LSCC in the last decades, it is still one of the considerable causes of cancer deaths and an urgent need for development of novel therapeutic approaches against advanced LSCC cases still remains. MiR-1825, located inside the 7th exon of POFUT1 (protein O-fucosyltransferase 1) gene, resides within 20q11.21 chromosomal region, where has been reported to be a recurrent gain of function abnormality in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Nguyen et al. reported that human embryonic stem cells with 20q11.21 amplification displayed increased colony forming potential and decreased apoptosis. Interestingly, 20q11.21 amplification in human embryonic stem cells resulted in acquisition of a gene-expression signature enriched for cancer-associated genes and miR-1825 expression was reported to be elevated in a variety of carcinomas. POFUT1, the host gene of miR-1825, has been shown to be upregulated in several cancers including hepatocellular carcinoma, gastric cancer, brain cancer, colorectal cancer, and oral squamous cell carcinoma. Bioinformatics analysis using 522 head and neck cancer samples and 44 normal head and neck tissue samples from the Cancer Genome Atlas (TCGA) database showed that the POFUT1 expression was significantly increased in tumor samples compared to normal tissue samples. In our recent study, microRNA profiling of CD133+ and CD133- LSCC samples with microarray revealed that miR-1825 was significantly upregulated in CD133+ larynx cancer stem cells, which proposed miR-1825 as a specific oncogenic microRNA with potential roles in maintenance of stem cell associated features. Taking these findings into account, POFUT1 and miR-1825 are likely to be potential biomarkers; however, their effects and mechanisms during laryngeal carcinogenesis and their contribution to the stemness features of LSCC CSCs remain to be investigated. Here, we propose to study 30 tumor and 30 corresponding normal LSCC tissues for evaluation of POFUT1 and miR-1825 expressions using the clinically and histopathologically confirmed (by Ataturk University Medical School Department of Medical Pathology) samples that will be obtained from Ataturk University Medical School Department of Otorhinolaryngology. Further functional effects of POFUT1 and miR-1825 will be assessed on proliferation, migration, apoptosis, stem cells characteristics of LSCC Hep-2 cell line and control immortalized HuLa-PC larynx epithelial cells in vitro and tumorigenic capacity in vivo. We also aim to carry out functional analysis using bioinformatics tools and gene expression arrays for miR-1825 to identify possible novel target genes for understanding its roles in LSCC pathogenesis.