Stenotrophomonas Maltophilia'dan Kitinaz Enziminin Saflaştırılması, Karakterizasyonu ve Biyoteknolojik Uygulamaları

Abstract

Bu tez çalışması kapsamında; kültür koleksiyonumuzda bulunan bakteri izolatlarının kitinaz aktiviteleri araştırıldı ve en iyi kitinaz aktivitesi gösteren izolat belirlenerek klasik (morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal) ve moleküler yöntemlerle (16S rRNA dizi analizi) tanılandı. Stenotrophomanas maltophilia (Gen Bank No: MW600524) olarak tanılanan izolattan kitinaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değişim kromatografisi yöntemiyle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin optimum sıcaklık ve pH'sı, Vmax ve Km değerleri ile sıcaklık ve pH stabiliteleri belirlendi. Enzim aktivitesi üzerine çeşitli metal iyonları (Ca2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+), reaktifler (%1-5 EDTA, H2O2, SDS, Tween 20 ve Tween 80) ve çözücülerin (%5-15 DMSO, aseton, gliserol, etanol, izopropanol) etkisi araştırıldı. Saflaştırılan kitinaz enziminin antifungal ve biyoinsektisit olarak kullanılabilirliğinin belirlenmesi amacıyla önemli tarımsal hastalık ve zararlılara karşı etkisi incelendi. Yapılan çalışmalar sonucunda kitinaz enzimi %30 amonyum sülfat konsantrasyonunda %40,7 verimle, 1,4 kat saflaştırıldı. Kısmi saflaştırmanın akabinde iyon değişim kromatografi tekniğiyle HiPrep Q XL 16/10 kolonu ve HiPrep™ 26/10 Desalting kolonu kullanılarak sırasıyla %25,34 ve %18,12 verimle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE yöntemiyle 52 kDa olarak hesaplandı. Enzimin optimum sıcaklığı 50 °C ve optimum pH değeri 7,0 olarak belirlendi. 1 mM konsantrasyondaki Fe2+, Cd2+ve Mn2+ iyonları ile 5 mM konsantrasyondaki Mg2+ ve Fe2+ iyonları enzim aktivesini artırırken, test edilen tüm çözücü ve reaktiflerin enzim aktivitesini düşürdüğü tespit edildi. Kolloidal kitin için enzimin Vmax ve Km değerleri sırasıyla 1,07 µmol.ml-1.dk-1 ve 0,6 mg/ml olarak hesaplandı. Saflaştırılan enzimin Fusarium oxysporium'un çimlenmesi ve hifsel gelişimini olumsuz etkilediği, Leptinotarsa decemlineata böceğinin ise kitin yapısında bozulmalara sebep olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Stenotrophomanas maltophilia, kitinaz, enzim saflaştırma, antifungal aktivite, biyoinsektisitWithin the scope of this thesis, the chitinase activities of the bacterial isolates in our culture collection were investigated and the isolate with the best chitinase activity was determined and identified by classical (morphological, physiological, biochemical) and molecular (16S rRNA sequencing) methods. Chitinase enzyme was purified from the isolate identified as Stenotrophomonas maltophilia (Genbank No: MW600524) by ammonium sulphate precipitation and ion exchange chromatography. Optimum temperature and pH, Vmax and Km values, and temperature and pH stability of the purified enzyme were determined. The effects of various metal ions (Ca2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+), reagents (%1-5 EDTA, H2O2, SDS, Tween 20 andTween 80) andsolvents (%5-15 DMSO, acheton, glycerol, ethanol, isopropanol) on enzyme activity were investigated. The effect of purified chitinase enzyme against major agricultural diseases and pests was investigated in order to determine its usability as antifungal and bioinsecticide. According to the results of the studies, the chitinase enzyme was purified 1,4 times at 30% ammonium sulphate concentration with a yield of 40,7%. Following partial purification, the enzyme was purified by ion exchange chromatography technique using HiPrep Q XL 16/10 column and HiPrep ™ 26/10 desalting column with 25,34% and 18,12% yields, respectively. The molecular weight of the purified enzyme was calculated as 52 kDa by SDS-PAGE method. The optimum temperature of the enzyme was determined to be 50 °C and the optimum pH value as 7,0. While Fe2+, Cd2+ and Mn2+ ions at 1 mM concentration and Mg2+ and Fe2+ ions at 5 mM concentration increased enzyme activity, all the tested reagents and solvents decreased the enzyme activity. Vmax and Km values of the enzyme for colloidal chitin were calculated as 1.07 µmol.ml-1.dk-1 and 0,6 mg/ml, respectively. Purified enzyme negatively affected the germination and hyphal development of Fusarium oxysporium, and caused deterioration in the chitin structure of the Leptinotarsa decemlineata insect. e Keywords: Stenotrophomanas maltophilia, chitinase, enzyme purification, antifungalactivity, bioinsecticide