Hidrofobik Protein DewA'nın Pichia pastoris ile Rekombinant Üretimi ve Biyoteknolojik Uygulamaları

Abstract

Hidrofobinler, adeze olarak yüzey karakteristiğini değiştirebilme özelliklerinden dolayı birçok biyoteknolojik uygulamada büyük potansiyele sahiptir. Son yıllarda, hidrofobinlerin biyoteknolojik uygulamalarında belirgin bir artış olmakla birlikte, endüstriyel boyutlarda üretimi verim problemlerinden dolayı hala başarılmış değildir. Bu nedenle hidrofobinlerin rekombinant üretimi üzerine daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu tez çalışmasında literatürde yüksek temas açısına sahip olduğu belirlenen Aspergillus nidulans'a ait sınıf I hidrofobin DewA proteininin rekombinant olarak üretimi amaçlanmıştır. Bu amaçla ilk olarak, DewA geninin (UNIPROT: 52750) salgı sinyal dizisi ve dur kodonu çıkarılmıştır. Daha sonra elde edilen diziyi kesmeyen restriksiyon enzimleri biyoinformatik programı kullanılarak tespit edilmiş ve diziye EcoRI ve XbaI enzim kesim bölgeleri eklenmiştir. Ardından kodon optimizasyonu gerçekleştirilerek, dizi sentezlettirilmiştir. Sonuçta DewA proteini pPICZα-A vektörüne aktarılarak AOX1 promotörü altında Pichia pastoris X-33 suşu kullanılarak rekombinant olarak üretilmiştir. En yüksek verim 96. saatte 77 mg/L olarak %1'lik metanol konsantrasyonunda elde edilmiştir. Elde edilen rekombinant proteinin moleküler ağırlığı yaklaşık 15 kDa olarak bulunmuştur. DewA proteinin cam yüzeye kaplanması sonucunda, yüzeyin karakteristiğini değiştirerek hidrofobik hale getirdiği; teflon yüzeylerde ise yine yüzey karakteristiğini değiştirerek, hidrofilik hale getirdiği kanıtlanmıştır. Ardından bu yüzeylere sıcak SDS ve UV uygulaması yapılarak proteinin yüzey stabilitesi değerlendirilmiştir. Sonuçta yüzeye kaplanmış olan DewA proteininin hem cam hem de teflon yüzeylerde sıcak SDS uygulamasına dirençli olduğu; UV uygulamasında ise, cam yüzeylerde UV maruziyeti ile protein degrede olurken, teflon yüzeylerde yapısını koruduğu anlaşılmıştır. Tez çalışması ile A. nidulans'a ait DewA proteini, pPICZα-A vektörüne klonlanarak, P. pastoris X-33 suşunda AOX promotörü kontrolünde ilk kez rekombinant olarak üretilmiştir.Hydrophobins have great potential in many biotechnological applications due to changing their surface characteristics as they adhere to surfaces. In recent years, although there has been a significant increase in the biotechnological applications of hydrophobins, industrial production has still not been achieved due to yield problems. Therefore, more studies are needed on the recombinant production of hydrophobins. In this thesis, the recombinant production of class I hydrophobin DewA protein belonging to Aspergillus nidulans, which is determined to have high contact angle in the literature, was aimed. For this purpose, firstly, the secretion signal sequence and the stop codon of the DewA gene (UNIPROT:52750) were removed. Then, the restriction enzymes that did not cut the obtained sequence were determined using the bioinformatics program and EcoRI and XbaI enzyme cutting sites were added to the sequence. Then, sequence synthesis was made after codon optimization. As a result, DewA protein was recombinantly produced using P. pastoris X-33 strain under AOX1 promoter by transferring into pPICZ a-A vector. The highest yield was obtained at 1% methanol concentration as 77 mg/L in 96 hours. The molecular weight of the obtained recombinant protein was about 15 kDa. As a result of coating the DewA protein on the glass surface changes the surface characteristics and makes it hydrophobic; On teflon surfaces, it has been proven to change the surface characteristics and make them hydrophilic. Then, the surface stability of the protein was evaluated by applying hot SDS and UV to these surfaces. As a result, the surface-coated DewA protein was resistant to hot SDS application on both glass and teflon surfaces; ın the UV application, it was understood that while the protein was degraded by UV exposure on glass surfaces, it preserved its structure on teflon surfaces. In the thesis study, the DewA protein of A. nidulans was cloned into the pPICZα-A vector and recombinantly produced for the first time in the P. pastoris X-33 strain under the control of the AOX promoter.